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Bito - Klonierung

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Klonierung

VL1

Grundlage Isolierung, Klonierung, Anaylse von Genen:

  • Trennung der Gene
  • Selektive Vermehrung (vitro (PCR), vivo (Vektoren))
  • Ligation
  • Transformation
  • Selektierbarkeit (Marker)

Pro E. coli

  • Billiges Nährmedium
  • Generationszeit
  • Vektoren (Plasmide)
  • Gute Transformation mit Plasmiden
  • Leicht mit Phagen zu infizieren
  • Plasmiden leicht von chrDNA trannbar
  • K12-Laborstämme
  • Voll sequenziert (4600)

Restriktionsendonukleasen 3 Typen

Typ II – Restriktionsenzyme erzeugen verschiedene Enden

  • EcoRI  sticky, 5’ overhang, GAATTC
  • EcoRV  blunt
  • PstI  sticky, 3’ overhang

Methylierung in E. coli

  • EcoKI  Restriktion fremder DNA
  • DAM (methyliert an Adenosin)  DNA-Reparatur
  • DCM  nich bekannt

Methylierung in Eukaryoten (Methyliere Promotoren inaktiv, Inaktivierung von Repetitiven Sequenzen)

  • Hefe keine
  • Wirbeltiere  an Cytosin (CG)
  • Pflanzen  an Cytosin (CNG)

VL2

Vektoren

Plasmide:

  • Zirkulär, ds DNA
  • Unabh. Repliziert
  • Resistenzen
  • Konjugation

Konjugation:

  • Tra-Gene (Pili-Synthese)
  • Mob-Gene (Mobilisierungsproteine)
  • Nick/bom-Gene (oriT(ransfer) = Mobilisierungsstelle)
  • Vorgang: mob-Prot. bindet an nick/bom  Relaxationskomplex  Strangbruch  ssDNA übertragen

Replikation und Verteilung

  • Unidirektional u. > bidirektional
  • oriV = Replikationsursprung
  • Kopienzahl:
    • Bei pMB1 (ColE1) Replikationskontrolle durch selbst synthetisierte RNA (Hybridbildg)
    • Rop-Protein (repressor of Primer)  stabilisiert Hybridbildg.  repl. Senkung
    • Relaxiert kontrollierte Replikation  hohe Kopienzah, Stringent kontr. Repl.  geringe Kopzahl.
  • Verteilung:
    • Gleichmäßige Verteilung auf Tochterzellen = Stabilität eines Plasmid
    • par-Loci (partition)
    •  cis Lokus  Anheftg. Der Plasmiden an Membran

Zusammenhänge für Plasmiden:

  • je kleiner Plasmid, desto höher Kopienzahl
  • je niedriger Kopienzahl, desto höher Stabilität
  • kleine Plasmide  geringe Stabilität

Inkompatibilität und Wirtsbereich

  • Inkompatibilitätsgruppen (Inc) = Verwandte Plasmide  nicht stabil repliziert u. weitervererbt
  • Da: = Replikationsaparat (oriV), = Elemente f. Kopienzahl, = Elemente f. Verteilung
  • Narrow host range (z.B. ColE1)
  • Broad host range (RK2)  shuttle-Vektoren

Antibiotike und Resistenz:

  • Metabolite mit nierigem Molekulargewicht (1000 D)
  • Hemmen Wachstum  inhibieren essentielles Makromolekül
  • Mechanismen der Resistenz
    • Mutation des Zielproteins
    • Erhöhte Produktion des Zielproteins
    • Chem. Veränderung der anbak. Substanz
    • Verhinderung der Aufnahme

Antibioika Wirkungsweise:

  • Beta-Lactam-Antibiotika: Ampicillin, Bak., Inhib. Zellwand-Synthese, spaltung beta-Lactam-Ring durch beta-Lactamase
  • Tetracycline, Bak., Inhib. Proteinsynthese (ribosomale Proteine), Aufnahme verhindert durch Membranproteine
  • Aminoglycoside: Kanamysin, Bak./Euk., Inhib. Proteinsynthese
  • Chloramphenicol, Bak., Inhib. Proteinsynthese, Acetylierung durch CAT
  • Blemocin-Familie, Bak/Euk, DNA-Degration, Bindg. Des Antibitotikums

Eigenschaften Klonierungsvektoren:

  • Autonome Replikation
  • Klein (bessere Effizienz v. Ligation)
  • Selektionsmarker
  • Keine Restriktionsstellen abseits der Insertstelle
  • Viele singuläre Restriktionsstellen bei Insertstelle
  • Singuläre Restriktionsstelle in Marker (Resistenzgen)  Inaktivierung bei Insert
  • Hohe Kopienzahl (pBluescript 100)
  • Verbreitung nicht über Konjugation

pBR322-Vektor:

  • PstI (Schnittstelle=Klonierungsstelle) in Ampicillin-Resistenz-Element (ApR)
  • Tetracyclin-Resistenz (TcR)
  • Identifizierung von Rekombinanten mit pBR322 (siehe Buch)
  • Nachteile
    • Relativ Groß
    • Wenige Schnittstellen
    • Selektion umständlich (Stempeln)
    • Keine zusätliche Schnittstelle neben Klonierstelle (für Removing)

Lac-Operon: Repression durch Lac-Repressor:

  • lacZ  beta Galactosidase (Lacrosespaltung  Glucose)
  • lacY  Lactose-Permease (Lactoseaufnahme)
  • lacA  Transacetylase (entgriftet toxische Galactoside)
  • lacI gehört nicht zum Operon  Lax-Repressor (bindet an Lac-Operon, verhindert Transkription)
  • natürlicher Indukor (Gegeteil v. Inhibitor) = Allolactose (v. beta Galactosidase gebildet)

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