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V1

Zellaufschluss- Sonifikation- Chromatographie- Gel-Filtration

Wahl des Expressionsorganismus ist abhängig vom Protein, das expremiert werden soll. Unterschiede in der posttranslationalen Modifikation und Glycosylierung u.a. spielen eine Rolle in der Auswahl. Bei einigen pflanzlichen Proteinen zur Gewinnung von pflanzlichen Allergenen ist die Expression in transgenen Pflanzen von Vorteil (G. Obermeyer et al., Methods 32 (2004) 235-240). Viele pflanzliche Proteine zeigen jedoch auch bei Expression durch E. coli keine Qualitätsnachteile (Beispiel: betv1). Es existieren gut etablierte Expressionsysteme: Hier kann z.B. auf ein Expressionssystem folgender Konfiguration verwendet werden: Das gene of interest steht unter Kontrolle des T7-Phagen-Promotor. Dieser wird nur durch die effiziente T7-Polymerase erkannt. Diese kann in E. coli, durch Induktion durch IPTG (Lac-Promotor) zur Expression gebracht werden. Dies führt schließlich zur Expression des gewünschten Gens. Zur Voroptimierung können Expressionstest durchgeführt werden. Hierbei können unterschiedliche E. coli Stämme unter dem Einfluss differierende Temperaturen getestet werden. Besonders die Wahl der Temperatur ermöglicht die Optimierung hin zu einer maximalen Ausbeute an löslichen Proteinen. Man strebt an lösliche Proteine zu erhalten, da globuläre Proteine (inclusionbodies) Rückfaltung der Proteine nötig machen. Auch das Design genetischer Elemente (Tagging, Codon-Optimierung usw.) kann durchgeführt werden. Expression kann sekretorisch oder im Cytoplasma erfolgen. Letzter Expressionsart ist die Methode der Wahl, da nach Expressionsinduktion, Ernte und Zellaufschluss kleine Volumina mit hohem Proteingehalt (Richtwert min.10mg/ml) erhalten werden könne. Das verwendete Aufschlussverfahren richtet sich nach Art der eingesetzten Expressionssysteme. Säugerzellen, können via pH-Schock aufgeschlossen werden (keine Zellwand). Gram-negative Bakterien können mit Lysozymen aufgeschlossen werden (Frage ii). Diese Methode eignet sich nicht für Proteine mit His-Tag, da Lysozym Nickel bindet. Dadurch kommt es bei der Reinigung der Proteine mittels Affinitätschromatographie (Ni-NTA Technik) zu kompetativer Bindung an die Matrix. Außerdem liegt Kontraindikation beim vor, wenn man mit Membranproteinen gramnegativer Bakterien weiterarbeite will (werden angegriffen). Weiter Möglichkeit des Aufschlusses bieten „Frieren und Tauen“ Technik, Glas-beads sowie die von uns verwendete Sonifizierung. Hierbei wird Ultraschall (~15-25 kHz, 10-50W) eingesetzt. Dazu wird eine Sonde in die Zellsuspension eingeführt. Ultraschall führt zur Bildung von Blasen in den Zellen, die implodieren. Dadurch werden kovalente Bindungen gebrochen und es kommt zum Aufschluss. Bei der Technik muss auf zwei Dinge geachtet werden (Frage i): Es kommt zu Wärmeentwicklung. Um Denaturierung der Zielproteine zu verhindern, sollte Probe auf Eis sonifiziert werden. Außerdem sollten Sonifizierung nur eine kurze Zeit (z.B. 30s mit einigen Wiederholungen) angewandt werden (=schonend). Bei unlöslichen Proteinen muss stärkere Sonifizierung angewandt werden. Weiterhin sollte Ultraschallsonde mindestens 2 cm in Suspension eingeführt werden, um Bildung von Blasen und reaktiven Sauerstoffspezies, die Proteine „angreifen“, zu verhindern. Das gewonnene Zelllysat muss danach schnell gereinigt werden, um Degradation durch Proteinasen sowie Denaturierung möglichst gering zu halten. Um festzustellen, ob das proteine of interest (deutsche Protokolle waren noch nie unsere Stärke) löslich oder unlöslich ist, wird folgend vorgegangen: Probe aus Zelllysat und Überstand aus abzentrifugiertem Zelllysat werden auf SDS-Gel aufgetragen. Lässt sich Bande des gewünschten Proteins in der Probe des Überstands finden und nicht nur im nicht abzentrifugierten Zelllysat, kann man auf ein lösliches Protein schließen. Bei löslichen Proteinen (im Überstand) erfolgen weitere Reinigungsschritte mit dem Überstand. Reinigung kann über verschiedene Chromatographieverfahren prozessiert werden. Oft wird Reinigung mit Kombination verschiedener Verfahren erzielt. Affinitätschromatographie beruht auf der Wechselwirkung von getaggten Proteinen (His-Tag, alternativ GST, Streptavidin) mit der Säulenmatrix. Es kommt zur Ausbildung von kovalenten Bindungen. Proteine ohne Tag, wandern mit mobiler Phase. Getaggte Proteine mit Tag binden an stationäre Phase und werden via Eluierung ( pH-, Salzgradient) gewonnen (His-Tag bindet an Nickel oder Kupfer der Stationären Phase). Bei Ionenaustauschchromatographie kommt es zur Trennung nach Ladung. Es gibt Anionen- (Matrix positiv geladen) und Kationenaustauscher (Matrix negativ geladen) unterschieden. Um diese Chromatographie anzuwenden muss der Isoelektrische Punkt (pI) des Proteins bekannt sein. Diese kann durch entsprechende bioinformatische Tools aus der Aminsäuresequenz errechnet werden. Diese ist bekannt, da auch die codierende Sequenz der DNA bekannt ist. Wenn Protein in Puffer mit pH>pI, ist das Protein negativ geladen (Anionenaustauscher); wenn pH<pI, ist Protein positiv geladen (Kationenaustauscher). Eluiert wird via steigender Salzkonzentration (linearer-, oder Stufengradient) bei konstantem pH (A. Thür et al., Übung Biotechnology, 2008). Hydrophobic interaction chromatography führt zu Trennung der Proteine nach Hydrophobizität und wird auch gerne angewandt. Eluierung via absteigenden Salzgradient und aufsteigenden pH-Gradient. Letzter Reinigungsschritt bildet die Gelfiltration (Größenauschschlusschromatographie). Letzte Verunreinigungen werden dadurch entfernt (Entsalzung, wandern langsamer). Hierbei findet keine direkt Wechselwirkung von Probe und Matrix statt. Keine Proteinaufkonzentration findet statt. Gradienten werden nicht eingesetzt. Nur Poreneffekt führt zur Trennung. Einstellung spezifischer Aufflösungsgrenzen, kann zur Gewinnung spezifischer Isoformen und Abtrennung von Mono- und Polymeren eingesetzt werden. Über Kalibrierung kann Proteingröße bestimmt werden. Reihenfolge des Säulendurchtritts: erst große Moleküle (z.B. Polymere), dann so mittelgroße (z.B. Monomere), dann kleinere Moleküle und Salze (Salzpeak). Im Proteomics Labor wird Chromatographie via FPLC (HPLC-Art, siehe Bild xxx) durchgeführt. Die Probe wird mit Spritze (Luftblasenfrei!) in konstanten Pufferfluss und dann in Säule eingebracht (Trennung). Nach UV-Detektion bei 280 nm (im PC graphisch Umgesetzt) wird Probe via Fraktionierer in Fraktionen aufgeteilt. Fraktionen können durch graphische Umsetzung identifiziert werden. Reihenfolge der Peaks: Void-Peak (Totvolumen), Proteinpeak, möglicherweise Peaks anderer Substanzen, Salzpeak, peak durch Säulenmaterial. Der Puffer muss entgast (keine Luftblasen, sonst Störung des konstanten Flusses) und filtriert werden (Eliminierung von Fremdstoffen). Eluierung durch Gradient (Gradientenmischer am Gerät) möglich. Säulenmaterial muss intert, chemisch- (pH-range 2-13) und physisch (max. 1,5 kPa) stabil sein. Reinigung und Pflege der (teueren) Säulen ist nötig. Säule darf nicht trocken laufen. Reinigung mit Azilsäure (gegen Mikroorganismen) sowie Lagerung in 20% EtOH bei 20°C.

Beantwortung der Frage iii: Nach Annahme eine Aminosäure entspricht ca. 110 Dalton, hat gesamtes Protein ~22 kDa (110*200). Bei Gelfiltration kommt es zu keiner Reduzierung des Proteins. Daher ist ein Molekulargewicht von ~22 kDa zu erwarten (a). Das gleiche trifft auf nicht reduzierende SDS-PAGE zu (b). Nur bei der reduzierenden SDS-PAGE kommt er zur Lösung der Disulfidbrücken zwischen den Peptiden (Disulfidbrücken zwischen zwei Cys-Resten werden mit Mercaptoethanol, Dithiothreit oder Dithioerythrit reduziert). Daher trennen sich die drei Dimere(2) des Hexamers(6). Die Dimere haben dann ein Molekulargewicht von ca. 7.3 kDa (22/3 bzw. 200/3*110) und werden als eine Bande auf Gel sichtbar.

V2

Affinitätschomatographie

Die Affinitätschromatographie wurde dazu benutzt um zwei His-getaggte Proteine zu reinigen. Das Säulenmaterial (Ni-Resin) wurde in Epprouvetten benutzt um mit kleineren Volumen arbeiten zu können. Gereinigt wurden Collagenase 1 (H, ~80kDa) und Collagenase 2 (G,~88,9kDa) aus Clostridium Histolyticum, im Konstrukt 1 und S2. Als Expressionssystem wurde E.coli verwendet. Die Collagenase 2 enthält eine PKD Domäne deren Funktion unbekannt ist.

Um die Proteine an die Säule zu binden wird der für einen His-Tag optimale pH 8 und eine niedrige Imidazolkonzentration. Um die Proteine wieder von der Säule zu eluieren wird die Imidazolkonzentration erhöht. Bindet das Zielprotein schlecht an das Säulenmaterial, so kann der pH-Wert erhöht werden (zB. mit Ammoniak(NH4)), bei schlechter Eluation wird die Imidazolkonzentration gleich gehalten und der pH-Wert gesenkt.

Wird die Säule/Resin-Eprouvette länger gelagert ist dies mit EtOH zu machen um eventuelles Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern, diese wäscht man anschließend drei mal mit Lysis Puffer.

Von beiden Eprouvetten wurde der Lysis Puffer-Überstand verworfen und mit 1mL Lysis Puffer geladen und sonst ebenfalls gleich mit beiden Proteinen verfahren. Zentrifugation: 5',2000g (durch Protein limitiert),5° (norm. 1min. ausreichend) Überstand verwerfen

Durchlauf : Das Resin mit der Proteinlösung (1mL) beladen, schwenken 15’ binden lassen Abzentrifugieren:5',2000g ,5° ->Überstand entnehmen->20µL Probe (VOR/ P1) entnehmen und mit 5µL 5x SDS-Puffer mischen, mit den anderen Proben gleich verfahren

-2 mal Waschen: Resin+ 1mL Wasch-Puffer Abzentrifugieren:5',2000g ,5° ->Überstand entnehmen->Probe(P2, P3)


-3 mal Eluieren: Resin+ 1mL Eluation-Puffer Abzentrifugieren:1',2000g ,5° ->Überstand entnehmen->Probe(P4, P5, P6)


Resin+ 1mL Lysis-Puffer

20µL der entnommenen Proben (P1-P6 G und H, die erste Waschung (P2) von H ging verloren), nach 3’ auf dem Heizblock (95°) denaturieren, auf das SDS-Gel auftragen. 5µL Marker.

Das Gel wird bei 190V laufen gelassen.


Lysis-Puffer: 50mM Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) 300mM Natriumchlorid (NaCl) 10mM Imidazol (C3H4N2)-> Bestandteil der Seitenkette der Aminosäure Histidin und verdrängt den His-Tag bei höheren Konzentrationen

Wasch-Puffer: 50mM Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) 300mM Natriumchlorid (NaCl) 20mM Imidazol (C3H4N2)

Eluations-Puffer: 50mM Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) 300mM Natriumchlorid (NaCl) 250mM Imidazol (C3H4N2)

Andere Reinigungsschritte neben der Affinitätschromatographie sind möglich und ratsam da ein Binden anderer Proteine, zB. An der Ni-Matrix möglich ist und das Protein in verschiedenen Oliomerisierungen vorliegen könnte. Gel Filtration bzw. Sice Exclusion Chromatography wäre möglich, besonders um die Homogenität zu testen/ erhöhen. Ist das Zielprotein geladen (relativ genau ausrechenbar) kann es bei der Ionenaustauschchromatographie an Säule gebunden werden. Die Reversed Phase Chromatography und die Hydrophobic Interaction Chromatography stehen auch noch zur Auswahl bereit, letztere wird aber eher seltener verwendet da sie leicht zur Denaturierung der Proteine führt. Der Vorteil in der Verwendung von Tags liegt darin, dass die Reinigungen sehr spezifisch sind, Tags die Löslichkeit erhöhen können und man sich dadurch vielleicht ein Rückfalten schlecht löslicher Proteine erspart.

V3

Lysozym Kristallisation

Für die Kristallisation wurde die sitting drop Methode ausgewählt, welche unkomplizierter in der Handhabung ist und obwohl die Dampfdiffusion nicht so effizient wie in der hanging drop Methode ausreichend für unsere Zwecke war. Im Reservoir werden verschiedenen Konzentrationen an PEG und NaCl zusammenpipettieren. In die Kristallisationsmulde werden zu 2µL Pufferlösungstropfen, 2µL der Proteinlösung (Lysozym mit Konzentrationen von 25, 50, 75 und 100µg/µL) pipettiert. Das 24er-Well wird mit Klebeband luftdicht abgeklebt und ruhig bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach 15 Minuten könnten schon Kristalle zu sehen sein. Die Kristalle wurden nach 3h betrachtet und auf Färbbarkeit und Zerbrechlichkeit getestet und nach 6 h dokumentiert.

Im Prinzip gibt es für jedes Protein die Bedingungen bei denen es Kristalle ausbildet. ?? Fremdproteine, welche sich ins Kristallgitter einordnen, verursachen eine Unregelmäßigkeit und dadurch zum Fehlen weiterer Anlagerungsmöglichkeiten und Abbruch des Wachstums. Einerseits gibt es eine Homogenität welche das Verhältnis zwischen Ziel und Fremdprotein beschreibt (der Zielproteingehalt sollte mindestens 95% betragen) und andererseits jene Homogenität welche das Verhältnis von Monomeren und Oligomeren unseres Zielproteins beschreibt. Letztere kann mittels chromatographischer Methoden ermittelt werden.

V4

Lissy und Hydra II

Diese Maschinen werden verwendet ohne großen manuellen Aufwand Kristallisationsplatten zu beladen. Lissy wird für die Herstellung von Reservoir-Gradienten genutzt und über drei verschiedene Programme bedient. Der „Layouter“ beschreibt dem Gerät wo welche Proben und Platten zu finden sind, im „Designer“ wählt man aus wie und was die Maschine später pipettieren soll und im „Runner“ werden die zuerst zusammengestellten Protokolle verarbeitet und ausgeführt. Die vier Spitzen können bis zu 900µL aufziehen und werden für längere Lagerungen mit 70% EtOH befüllt um mikrobielles Wachstum zu verhindern. „Hydra II“ wird für das befüllen der Kristallisationsmulden, also weitaus kleinerer Volumina verwendet. Mit den 96 Nadeln lassen sich die entsprechenden Wells befüllen. Ein Kontakt der Spitzen mit dem Well ist nötig um die bis zu 100nl kleinen Tropfen absetzen zu können. Der zusätzliche Apparat „Nano“ kann Volumina bis 10nL piptettieren. Dies ist möglich, indem der Apparat die Systemflüssigkeit Wasser mit einer Membran in Schwingung versetzt. Diese Schwingung breitet sich über eine Leitung bis an die Spitze aus. Dort wurde die Probe aufgenommen. Es bildet sich ein Tropfen, welcher Abbricht. Ist zwischen Probe und Systemflüssigkeit Luft, kann jene zur Gänze verwendet werden aber eine Probenabgabe unter 100nL ist nicht möglich, da diese Luft als Kompensator wirkt. Für erhöhte Genauigkeit muss das System entgast werden (zB. mit He) und gleich an die Systemflüssigkeit die Proben anschließen. Dies führt dazu, dass man den letzten Teil der Probe verwerfen muss. Um das zu verhindern wäre vielleicht ein Öl oä. als Systemflüssigkeit eine Möglichkeit. Ein sparse matrix- Screen umfasst verschiedenste Bedingungen (pH, Salz, Polymere,…), welche dazu führen könnten, dass das Zielprotein kristallisiert. Dazu ist es natürlich nützlich schon über einigen Eigenschaften des Proteins bescheid zu wissen. Erzielt man Ergebnisse (zB. „runde“ Kristalle) bei einer bestimmten Bedingung, dann verwendet man einen grid- Screen bei welchem man nur eine Bedingung ändert (zB. pH, [NaCl], …) und alle anderen Parameter beibehält. Um Verdunstung zu minimieren welche bei solchen Volumina sehr relevant ist (Dampf(!)diffusion), kann man schnell, bei niedrigern Temperaturen arbeiten aber auch direkt die Probe mit Öl überschichten, was aber wieder Probleme mit sich bringt.

N1

Mikroskopieren

N2

Manipulieren, Ernten, Färben, Brechen

N3

Frieren, Montieren, Datensammlung, Auswerten

N4

Graphik Raum

Hier wurden die letzten Arbeitsschritte, welche der Kurs umfasst behandelt. In die aus der Röntgenkristallographie gewonnenen Elektronenwolken wird/werden die bekanneN AminosäurenketteN eingefügt. Dies geschieht mit Hilfe der bekannten Struktur anderer Proteine, Kräfte- und Wahrscheinlichkeitsberechnungen, wobei die R-Faktoren einem (?)…. Bei den Modellverfeinerungen ist der

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